Análise metabólica sérica para detecção de lesão hepática pré-neoplásica em pessoas com fragilidade aumentada pela idade

Introdução

O projecto individual "Análise metabólica sérica para detecção de lesão hepática pré-neoplásica em pessoas com fragilidade aumentada pela idade" visa validar os resultados obtidos num estudo recente realizado num pequeno número de doentes com tumores hepáticos (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30325540) para confirmar a capacidade de diagnóstico de um grupo de metabolitos seleccionados. 

Com a idade avançada é mais frequente que surjam doenças hepáticas graves em consequência da exposição, em maior ou menor grau ao longo da vida, a diferentes tipos de agentes (álcool, vírus, medicamentos, dietas ricas em gorduras e/ou açúcares). O fígado tem uma elevada capacidade de regeneração quando sofre danos mas, quando isto acontece durante um período prolongado de tempo, existe uma inflamação crónica do tecido, o que é considerado um factor de risco para o desenvolvimento de tumores hepáticos. Além disso, deve-se ter em mente que o fígado é mais sensível a diferentes agressões em pessoas idosas.

O carcinoma hepatocelular (HHC), que se desenvolve nos hepatócitos, é o cancro de fígado mais frequente, enquanto o colangiocarcinoma (CCA), que se desenvolve nas células que formam os canais que transportam a bílis do fígado para o intestino, é mais raro, mas é um tipo de tumor muito agressivo, cuja incidência tem aumentado nos últimos anos nos países ocidentais. O HHC desenvolve-se em 90-95% dos casos em fígados cirróticos devido a doença alcoólica ou hepatite viral, enquanto o CCA pode desenvolver-se em indivíduos com cirrose, com fígado gordo não alcoólico, com doenças hepáticas associadas à colestase crónica, como a colangite esclerosante primária (PSC), e também em indivíduos sem lesão hepática identificada.

Ambos os tipos de tumores são caracterizados por um desenvolvimento silencioso, o que justifica que geralmente sejam diagnosticados em estágios avançados, quando os pacientes não são candidatos à cirurgia, o que é a principal opção potencialmente curativa. Considerando os dois tipos de tumores hepáticos, o diagnóstico ocorre principalmente em pessoas com mais de 55 anos. A Figura 1 mostra os dados de incidência registrados em Salamanca nos últimos 5 anos com pacientes distribuídos por faixas etárias ao diagnóstico, que são semelhantes aos descritos no resto de Espanha e em países europeus.

Figura 1. Incidência de tumores hepáticos em Salamanca nos últimos 5 anos distribuídos por faixa etária.

Quando os pacientes apresentam sintomas, eles podem ser semelhantes em ambos os tipos de tumores, sendo utilizada uma combinação de testes de anatomia radiológica, bioquímica e patológica, bem como o estudo da história clínica do paciente para fazer o diagnóstico. Embora as técnicas radiológicas tenham melhorado muito nos últimos anos, nem sempre fornecem resultados conclusivos. Por outro lado, às vezes a localização do tumor impede a obtenção de uma biópsia e os marcadores tumorais que são determinados no sangue para auxiliar o diagnóstico, a alfa-fetoproteína (AFP) para o HHC e o antígeno 19-9 (CA 19-9) para o CCA não são específicos. 

A obtenção de um diagnóstico preciso é muito importante, pois cada tipo de tumor requer tratamento com fármacos específicos para obter ótimos resultados. Esses fatos justificam novas pesquisas para identificar marcadores específicos e sensíveis, preferencialmente por meio de análise minimamente invasiva em amostras de sangue, para permitir um diagnóstico definitivo dos pacientes para que eles possam receber o tratamento mais adequado e também para acompanhar a resposta dos tumores durante o tratamento.

Ao contrário dos estudos que analisam o tecido tumoral, que é normalmente obtido no momento em que o tumor é diagnosticado, o sangue oferece a possibilidade de medir marcadores que permitem acompanhar a evolução da doença. As tecnologias ómicas de elevado desempenho constituem uma nova alternativa para a identificação de marcadores úteis para o diagnóstico precoce e preciso do cancro. Dentro de essas tecnologias, a metabolómica ou a análise de metabólitos de baixo peso molecular (<1500 Da) em amostras biológicas tem um grande potencial.

O fígado desempenha um papel essencial numa grande variedade de processos metabólicos que são críticos para a manutenção da homeostase do corpo. Sabe-se que o dano a este órgão pode ter um reflexo no soro, em termos de desequilíbrio dos metabólitos no soro, devido à liberação de compostos de células danificadas e/ou de células tumorais com atividades metabólicas alteradas. A nossa hipótese é que a análise de certos metabólitos no soro pode ajudar a obter um diagnóstico definitivo do tipo de tumor hepático.

Temas de estudo e metodologia

Para a realização deste estudo, são utilizadas amostras de soro de pacientes com diagnóstico confirmado por anatomia patológica de HHC, CCA, fígado gordo em diferentes estágios da doença, colangite esclerosante primária (PSC) e outras hepatopatias, com diferentes faixas etárias (mais de 65 anos) e indivíduos saudáveis (controle).

A Figura 2 mostra uma representação esquemática dos diferentes estágios para a análise dos metabólitos no soro por meio de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massa (HPLC-MS/MS).

Primeiro, as amostras são processadas com diferentes solventes (metanol, ou uma mistura de clorofórmio e metanol) para extrair os metabólitos agrupados por famílias com propriedades físico-químicas semelhantes (aminoácidos, triglicérides, esteróis, ácidos biliares, etc.). Os diferentes extractos são injectados no aparelho HPLC-MS/MS, que os separa, obtendo picos correspondentes a cada composto. Após o processamento dos dados, obtém-se a concentração de cada metabolito na amostra e, subsequentemente, efectua-se uma análise estatística para determinar quais são especificamente alterados em cada patologia e para determinar o seu valor diagnóstico para cada tipo de patologia.

Figura 2: Fluxo de trabalho para a determinação do perfil metabólico. A) A extracção dos metabolitos é efectuada dividindo as amostras em grupos de espécies com propriedades físico-químicas semelhantes, após adição de um padrão interno. (B) Utilizam-se três plataformas para obter o perfil do metaboloma no soro por meio de UHPLC-MS. C) Pré-processamento dos dados gerados a partir das áreas dos picos dos cromatogramas correspondentes aos metabolitos detectados em cada injecção. É definida uma gama de detecção linear para cada metabolito identificado. Realiza-se uma normalização intra e inter-lote graças à correção com o padrão interno e o controle de calibração. (D) Uma vez normalizados os dados, é realizada a análise dos dados multivariados e univariados. (E) Seleção dos melhores biomarcadores candidatos para o diagnóstico de cada tipo de doença. 

Se forem identificados biomarcadores específicos e sensíveis para o diagnóstico de tumores hepáticos e que permitam a discriminação entre HHC e CCA, os idosos em grupos de risco para o desenvolvimento destes tumores poderão ser acompanhados para os detectar nas suas fases iniciais e melhorar as suas hipóteses de cura. 

Referências

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